Một trong những yếu tố quan trọng giúp Super Mario trở nên đặc biệt chính là hệ thống nhân vật phong phú và đa dạng. Ngoài Mario và Luigi, trò chơi còn có rất nhiều nhân vật phụ nổi bật, như công chúa Peach, Bowser, Yoshi, Toad, và Donkey Kong.